酵母发酵生产

酵母是一类包括酿酒酵母和非常规酵母在内的多种单细胞真菌的总称，天然酵母资源具有丰富的生物多样性和功能多样性。随着高通量筛选技术方法的进步，大量高效的酵母遗传元件已被开发利用，不同酵母底盘也被更广泛应用，酵母基因组编辑技术和染色体工程技术也已趋于成熟，酵母生理代谢调控的机理认识也更深入，工业上已利用酵母构建高效的细胞工厂，进行生物炼制、生产高值产品等。

安必奇拥有成熟的重组表达和纯化技术，配备了不同规格的发酵罐，以及高密度微生物发酵技术平台，满足不同的产量要求。我们可以构建和筛选酵母底盘，进行发酵工艺开发，包括基础培养基筛选、补料培养基优化及筛选，评估和优化关键发酵工艺参数、建立控制策略，还能实现大规模的下游纯化，纯化方法包括亲和纯化、离子交换、分子筛、疏水和反相等。

平台设施

发酵生产用酵母菌株

▪ 毕赤酵母

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。工业上常用其进行外源蛋白的诱导表达。利用毕赤酵母可以进行高密度发酵生产单细胞蛋白。

毕赤酵母表达系统的优势：

• 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。

• 培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。

• 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。

• 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能，可实现胞内表达和胞外分泌表达两种形式。

▪ 酿酒酵母

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）也是应用较多的重要工业微生物，广泛应用于生物医药、食品、轻工和生物燃料生产等不同生物制造领域。酿酒酵母能够进行高密度发酵，安全可靠。启动子位于结构基因5'端上游区，是RNA聚合酶的结合区。启动子区的结构影响其与RNA聚合酶的亲和力，进而影响基因的转录表达效率。通过对启动子改造，筛选强启动子，可以构建酿酒酵母的高效表达系统。

酵母发酵服务

安必奇提供酵母菌种全面的构建和发酵生产服务。我们可以从客户提供的DNA或蛋白质序列开始，到交付出高产量、高品质且稳定的菌种库，以及满足不同应用需求的终产物。

▪ 菌株构建

定制化构建酵母基因工程菌株（基因优化、表达质粒构建、阳性菌株筛选、高拷贝菌株筛选、工程菌株优化），得到的高产菌株易于进行工业化发酵，生产能力强，可以降低生产成本，提高经济效益。

▪ 发酵优化

发酵条件的优化（培养基及补料优化，溶氧量、温度、pH值控制）
大规模发酵生产

▪ 纯化工艺优化

通过疏水、亲和、凝胶过滤色谱、离子交换等纯化方式可获得纯度大于95%的目标蛋白。

▪ 冻干工艺优化

冻干过程包括三个阶段：（1）冷冻阶段，（2）初级干燥阶段和（3）二次干燥阶段。对多种条件下冷冻干燥试验过程中的关键参数进行优化，在不影响冻干制品质量的前提下（保证低的水分含量、具备优良的产品外观），缩短冻干工艺的周期。

酵母发酵服务优势

安必奇拥有丰富的蛋白表达经验，开发了抗体、高糖基化修饰蛋白、酶等品种技术，酵母表达体系成熟，可从基因优化、酵母工程菌株的筛选、表达质粒的构建，以及小试条件探索到放大发酵条件优化的完整试验能力。自主改造的高表达质粒，也已成功应用于酵母表达体系，能够为客户提供高质量、定制化的技术服务。

酵母发酵应用

毕赤酵母在药物和制药领域成功表达了融合蛋白M-IL-2(⁸⁸Arg、¹²⁵Aia)、S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)、人体干扰素α2b、白细胞介素-II、C型溶菌酶Lyzl6等，在食品酶制剂领域中成功表达了果糖酶等，在饲料领域成功表达了植酸酶、木聚糖酶、β葡聚糖酶等，其中有些产品已实现商品化和产业化。天然酿酒酵母菌株不仅应用于食品和酒精类产品的发酵，也能生产燃料乙醇，还能利用合成生物学技术对酿酒酵母进行改造合成天然产物，实现稳定可持续的生产和调控合成，例如生产阿片类药物、天然维生素E类化合物等。

服务案例

案例1：

使用巴斯德毕赤酵母菌株高效表达肌红蛋白（基因 ID：397467，编码猪肌红蛋白 MB 基因）。

▪ 巴斯德毕赤酵母表达宿主选择
使用 Pichia X33、Pichia KM71、Pichia SMD1168 或 Pichia GS115 作为宿主。
毕赤酵母基因组中的 ku70 基因 (GeneID:8199462) 通过 CRISPR/Cas9 系统被敲除。
巴斯德毕赤酵母基因组中敲除一种或多种主要降解重组蛋白的蛋白酶基因，例如pep4 (GeneID:8200047)、yps1-1 (GeneID:8196641)和prb1 (GeneID:8196728)。
基因工程菌株为X33-Δku70-Δyps1-1-MB菌株。

▪ 表达载体选择
pPICZ alpha A、pPICZ alpha B、pPICZ alpha C 或 pPIC9K

▪ 促进溶解的标签选择
TrxA、Sumo、GST、MBP、TF 或 NusA

▪ 发酵系统优化
发酵培养基包括但不限于YNB、YPD、BMM或BMMY培养基
发酵时间（48h）
分泌表达和下游纯化（His-Tag 蛋白纯化）

▪ 发酵产物验证