枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌的模式菌株之一，是常见的杆状细菌，能产生芽孢，广泛存在于土壤等自然环境中。因为其菌株基因组测序及必需基因解析较为清晰，枯草芽孢杆菌常被用作细菌遗传学及细胞代谢研究的模式菌株。除此之外，枯草芽孢杆菌菌株安全性强，被美国食品药品监督局(US Food and Drug Administration，FDA) 认定是公认的安全菌株(Generally recognized as safe，GRAS)。因为拥有生理生化特征清晰，遗传操作较为简单，分泌及表达能力强，培养发酵较为方便等优点，枯草芽孢杆菌还作为优良的底盘细胞，被改造为微生物细胞工厂，用于生产工业酶、维生素、功能糖、保健品及药物前体等目标产物，表现出了强大的工业生产应用能力。
安必奇拥有成熟的重组表达和纯化技术，配备了不同规格的发酵罐，以及高密度微生物发酵技术平台，满足不同的产量要求。我们可以构建和筛选枯草芽孢杆菌底盘，进行发酵工艺开发，包括基础培养基筛选、补料培养基优化及筛选，评估和优化关键发酵工艺参数、建立控制策略，还能实现大规模的下游纯化，纯化方法包括亲和纯化、离子交换、分子筛、疏水和反相等。
基于CRISPR-Cas系统多位点、多维度动态调控枯草芽孢杆菌底盘细胞
通过应用优化的CRISPR-Cas9基因编辑系统，可以进行基因组的多位点基因编辑。上调或下调体内不同基因，可对底盘细胞进行多基因、催化途径的多反应步骤的调控，全面优化底盘细胞。
利用生物传感器建立枯草芽孢杆菌的动态调控。 通过应用针对小分子的生物传感器，或将生物传感器与CRISPR-dCas9基因编辑系统相结合，调节下游基因，可以动态调节体内碳流，平衡细胞内的生长和生产。
利用CRISPR-dCas9系统进行多维调控。 优化CRISPR-dCas9基因编辑系统用于筛选蛋白质表达启动子文库、上调新生肽蛋白质折叠分子伴侣、抑制和消除蛋白酶表达。通过转录、折叠和修饰以及蛋白质成熟度的上调和保护来增强蛋白质的产生。
平台设施
枯草芽孢杆菌发酵服务
安必奇提供枯草芽孢杆菌全面的构建和发酵生产服务。我们可以从客户提供的DNA或蛋白质序列开始，到交付出高产量、高品质且稳定的菌种库，以及满足不同应用需求的终产物。
▪ 菌株构建
定制化构建枯草芽孢杆菌基因工程菌株（基因优化、表达质粒构建、阳性菌株筛选、高拷贝菌株筛选、工程菌株优化），得到的高产菌株易于进行工业化发酵，生产能力强，可以降低生产成本，提高经济效益。
▪ 发酵优化
发酵条件的优化（培养基及补料优化，溶氧量、温度、pH值控制）
大规模发酵生产
▪ 纯化工艺优化
通过疏水、亲和、凝胶过滤色谱、离子交换等纯化方式可获得纯度大于95%的目标产物。
▪ 冻干工艺优化
冻干过程包括三个阶段：（1）冷冻阶段，（2）初级干燥阶段和（3）二次干燥阶段。对多种条件下冷冻干燥试验过程中的关键参数进行优化，在不影响冻干制品质量的前提下（保证低的水分含量、具备优良的产品外观），缩短冻干工艺的周期。
枯草芽孢杆菌发酵服务优势
安必奇拥有丰富的蛋白表达经验，枯草芽孢杆菌表达体系成熟，可从基因优化、工程菌株的筛选、表达质粒的构建，以及小试条件探索到放大发酵条件优化的完整试验能力，能够为客户提供高质量、定制化的技术服务。
不断完善的基因组、转录组等代谢网络解析技术
生化合成新途径的设计和新酶的挖掘
开发与优化基因编辑工具，实现多位点基因编辑效率的提高
结合高通量基因克隆组装与高通量筛选技术，实现自动化、高通量的底盘细胞改造流程
开发基于胞内传感器的自调节系统
枯草芽孢杆菌发酵应用
枯草芽孢杆菌是一种具有研究开发潜力的微生物菌种，菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、麦芽糖酶、植酸酶、纤维素酶等酶类，也能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，还可以产生枯草菌素、短杆菌肽等活性物质。因其代谢产物的多功能性，枯草芽孢杆菌目前已在生物农药和生物肥料领域初步实现产业化，也在农林植物培育与保护、畜牧饲料、食品加工、环境保护等众多领域得到广泛应用。
服务案例
案例1：
重组枯草芽孢杆菌发酵生产乳铁蛋白及工艺优化
菌株构建
实验室构建重组枯草芽孢杆菌工程菌。
培养基
种子培养基：LB培养基
发酵培养基：TB培养基
发酵培养
菌种活化
摇瓶培养
重组菌株发酵培养
发酵条件优化
（1）考察不同种类的碳氮源对重组菌株生长和目的蛋白表达的影响，选取葡萄糖和胰蛋白胨作为碳氮源用于后续发酵。
（2）摸索pH值，综合菌体的生长和目的蛋白的表达结果，在发酵前7 h内将培养基的pH调节至7.5，以利于重组菌的生长，在7−16 h时，即发酵进入后期阶段将pH调节至7.0，以利于牛乳铁蛋白的积累。
（3）考虑菌体的生长条件（37 ℃）和牛乳铁蛋白表达量的适宜温度（28 ℃），选取28 ℃作为诱导温度。
（4）比较后选择25 h作为发酵时间。
响应面优化重组菌株发酵工艺试验
重组菌株10 L罐的发酵工艺优化
（1）采用分段控制转速的方式，在发酵前期主要考虑菌体的生长，而发酵后期主要兼顾目的蛋白的积累量。
（2）发酵前期采用30 ℃培养，在发酵后期采用28 ℃表达目的蛋白。
（3）设计二段式温度、pH对菌体生长和蛋白产量的调控实验。二段式发酵工艺优化使得牛乳铁蛋白表达量提高了2倍以上。
案例2：
枯草芽孢杆菌发酵生产聚-γ-谷氨酸
聚-γ-谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是微生物（主要为芽孢杆菌类）发酵的产物，由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）单体通过 γ-酰胺键聚合而成的一种阴离子高分子型聚合物。它的基本碳骨架分子呈直链型，主链上存在着大量的氢键、肽键和游离羧基，使γ-PGA具有水溶性、生物相容性和生物降解性能。另外，游离羧基使γ-PGA具有大量的活性位点，可发生交联、螯合、衍生化等反应，便于材料的功能化，易与其它材料聚合形成新型复合材料，使γ-PGA在医药、食品及化妆品、污水处理和农业等领域显示出广阔的应用前景。微生物发酵法具有条件温和、周期短、γ-PGA产量高且分子量分布合适等优点。我们对枯草芽孢杆菌的生产条件进行了优化，以提高γ-PGA产量和生产强度，降低其生产成本，为工业化生产提供理论基础和数据支撑。
接种量（a）、初始pH（b）、培养温度（c）、发酵时间（a, b）对 γ-PGA产量的影响
通过对枯草芽孢杆菌发酵生产γ-PGA的发酵条件进行优化，筛选出发酵培养基组分和培养条件的组合，γ-PGA产量达到20.8 g/L，比优化前提高了31.65%，适合工业化生产需要。
案例3：
VP28-cMyc-cwlCc 在B. subtilis 168 中的表达
(1) 目的基因合成与克隆
(2) 枯草芽孢杆菌168感受态细胞转化
(3) 阳性克隆筛选
(4) 表达式验证
(5) 阳性克隆扩增
PCR验证
Western Blot 检测蛋白表达
使用 Dot-Blot 检测蛋白质展示
参考文献：
JIN L, LI LH, ZHANG RZ, et al. Fermentation optimization for production of lactoferrin N-lobe by recombinant Bacillus subtilis. Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(7): 2628-2638.
