大肠杆菌发酵生产

原核发酵应用于许多工业环境，包括生物制药、食品和饲料、化学品和生物燃料的制造。在生物制药行业，原核微生物是生产质粒、蛋白质、肽和小分子等治疗药物的工具。其中，大肠杆菌表达系统是经济实用的原核表达系统，具有遗传背景清楚、易于培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短等优点。

图1 大肠杆菌工程菌商业化生产目标产物

服务项目

▪ 菌株构建

安必奇提供大肠杆菌基因工程菌株的定制化构建服务，得到的高产菌株易于进行工业化发酵，生产能力强，可以降低生产成本，提高经济效益。

▪ 发酵优化

发酵条件的优化（培养基及补料优化，溶氧量、温度、pH值控制）
大规模发酵生产

▪ 纯化工艺优化

通过疏水、亲和、凝胶过滤色谱、离子交换等纯化方式可获得纯度大于95%的目标蛋白。

▪ 冻干工艺优化

冻干过程包括三个阶段：（1）冷冻阶段，（2）初级干燥阶段和（3）二次干燥阶段。对多种条件下冷冻干燥试验过程中的关键参数进行优化，在不影响冻干制品质量的前提下（保证低的水分含量、具备优良的产品外观），缩短冻干工艺的周期。

平台设施

大肠杆菌发酵应用

大肠杆菌质粒生产

质粒是天然存在于细菌中的环状 DNA 分子，可以独立于基因组 DNA 进行复制。 质粒 DNA 在生物加工中发挥着重要作用，特别是在生物制药应用中，因为它涉及重组蛋白和病毒载体的生产。安必奇生物科技在利用大肠杆菌表达系统生产质粒DNA方面经验丰富，可为医药公司、工业客户提供从质粒构建、克隆筛选、菌种建库、工艺开发、非临床科研级质粒生产到GMP级别质粒生产的一站式个性化服务。

大肠杆菌重组蛋白表达生产

安必奇拥有多年的大肠杆菌重组蛋白表达经验，从蛋白性质分析，有很多蛋白及其结构域适合在大肠杆菌表达体系中表达。另外通过与 Sumo，Trx，GST 等标签融合也可以促进目的蛋白的表达及可溶表达。常见的表达产物包括毒性蛋白、生长因子、酶等，主要应用于作为抗原制备抗体、参与细胞实验与动物实验、测定蛋白酶活、研究蛋白相互作用(免疫共沉淀，GST pull down)、蛋白结晶结构研究、免疫组化实验等。

重组蛋白生产服务优势

• 成功交付上千种大肠杆菌体系重组表达蛋白，丰富的大肠杆菌重组表达资源，质粒（pET系列，pET28a，pET30a，pET43.1a等 ；pGEX4T-1，pBAD24，pGADT7，pQE-30等）、菌株齐全（BL21 (DE3)、OrigamiB(DE3)、Rosetta(DE3)、 BL21 CodonPlus(DE3)、ESL等），多种表达条件优化，增加可溶性蛋白表达量。

• 具备大肠杆菌表达可溶蛋白及体外复性蛋白 g 级生产能力。

• 大规模蛋白生产的平台，发酵罐、高压均质机等设备齐全。

大肠杆菌化工原料生产

大肠杆菌可以用于生产各种代谢产物和化学物质，如多肽、氨基酸、生物柴油、有机酸、多糖、抗生素等。大肠杆菌基因组改造可以发现新的特殊产物的基因，以及重要代谢过程和代谢产物生成相关的功能基因。安必奇生物提供定制化的大肠杆菌基因组编辑服务，优化代谢通路，提升代谢产物产量，实现工业化生产多种化工原料。

服务案例

案例1：

将重组质粒pET-SUMO-FGF21转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 细胞中。5 mL Luria-Bertani (LB)培养基（1% 蛋白胨、1% 酵母提取物和0.5%氯化钠pH 7.0，含有100 μg/mL氨苄青霉素），37°C 、250 r/min摇瓶培养包含重组质粒的单克隆。过夜培养后，将 500 μL 培养物转移至 50 mL 新鲜 LB 培养基中进行指数生长。通过SDS-PAGE分离SUMO-FGF21，使用密度计扫描测量融合蛋白的产量，经过多个层析步骤回收高产率的重组质粒。

案例2：

根据客户的要求，利用大肠杆菌表达目的蛋白，并成功交付纯化的蛋白和CoA。 QC数据如下：

PCR验证

目的蛋白诱导表达

蛋白表达情况分析

目的蛋白纯化

案例3：

在大肠杆菌内构建青蒿酸的生物合成途径，通过生物合成青蒿酸，再通过体外化学合成得到青蒿素， 几周内便可大量生产青蒿素。使用可控的 100 立方米工业发酵罐，可以替代 5 万亩的传统农业种植生产青蒿素，显著降低生产成本，具备低碳、绿色、环保的优势。

案例4：

在大肠杆菌中实现了VB12的从头合成，首先解析VB12好氧合成路径中钴螯合与腺苷钴啉醇酰胺磷酸的合成机理，将来源于5 种细菌中的28 个基因在大肠杆菌细胞中成功异源表达，并按其人工合成途径划分为5 个模块进行人工途径组装，最终实现VB12的从头合成，通过途径优化和发酵过程调控，产量达到307.00 μg/g 干细胞菌体，合成菌种发酵周期仅为工业生产菌株的1/10，具有工业应用前景。