CRISPR-Cas9 （Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9）是古细菌和细菌在与噬菌体抗争的进化过程中逐渐形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗外源入侵的DNA和病毒。CRISPR/Cas9系统将入侵质粒DNA和噬菌体的片段整合到CRISPR中，并利用相应的crRNA (CRISPR-derived RNAs)通过碱基互补配对方式与tracrRNA (trans-activating RNA)结合形成crRNA/tracrRNA复合物，该复合物能够引导具有核酸酶活性的Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，导致同源核苷酸序列的降解，进而提供免疫性。由于效率高、成本低等优势，CRISPR/Cas9基因编辑技术是目前基因组研究中的宠儿，被称为“基因魔剪”。
图1. CRISPR-Cas9系统
基因治疗简介
基因治疗是指通过特殊的方法来改变患者的遗传物质，将人的正常基因或者有治疗作用的基因通过一定方式导入患者的靶细胞内，在体内或者体外直接针对患者的异常基因本身进行治疗，从而达到治疗疾病的目的。体内基因治疗是指将治疗基因直接注入患者体内，而体外治疗需将靶细胞在体外修复扩增后再输入患者体内，如CAR-T疗法。相比于体内治疗，体外治疗的难度低、流程少，载体要求和安全性高，但实际应用有局限、且难以长期保持功效。
针对致病基因突变明确的遗传疾病(如罕见病)，基因治疗特异靶向原有变异基因进行功能修复而达到治疗目的，属于典型的精准医学范畴。由于CRISPR基因组编辑体系的载体构建容易、编辑效率有效、靶向位点选择灵活，在基因治疗开发方面具有很大的应用前景。
图2. CRISPR-Cas9基因治疗的体内和体外策略
CRISPR-Cas9在基因治疗遗传性疾病方面的应用
目前， CRISPR/Cas9 技术已应用于镰状细胞性贫血、地中海贫血、杜氏肌营养不良、Crygc 基因突变引发的白内障、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊性纤维化、遗传酪氨酸血症Ⅰ型等遗传性疾病的研究报道。在动物实验中， 研究者们通过CRISPR/Cas9 技术编辑合子或早期胚胎中的基因组，构建基因修饰的新个体；或者改造生殖干细胞中的基因组，从而稳定遗传至子代。
然而，上述策略如果应用于人类，必然会引发伦理争议。CRISPR/Cas9 技术未来的临床应用，更有可能是与人类诱导多能干细胞技术相结合，采用基于患者定制的个性化治疗方案。目前，人类诱导多能干细胞的建系技术已相当成熟，制约其应用的主要因素在于定向诱导分化步骤。其中，像造血系细胞分化的研究相对更为深入，技术平台相对稳定。
CRISPR-Cas9在癌症方面的应用
2014 年，Torres等首次报道了应用CRISPR/Cas9技术构建癌症模型的研究。在该研究中Cas9 在特异sgRNA 的引导下，在染色体特定位点切割，使被切割的染色体发生倒位和异位，准确模拟了人类一些肿瘤例如尤文氏肉瘤和急性髓系白血病的形成过程。同年，Xue等运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将抑癌基因p53 和pten 进行双突变，成功地构建了肝癌动物模型。
Platt 等报道的肺腺癌小鼠肿瘤模型，是将器官靶向的各种亚型的AAV 载体作为CRISPR/Cas9 的递送系统，成功实现在脑、肝、肺等器官中Cas9 核酶的特异性表达。由此可见，AAV 载体与CRISPR/Cas9技术的联合运用将会在癌症的个体化治疗中发挥越来越重要的作用。
CRISPR-Cas9在治疗病毒感染性疾病方面的应用
对于病毒感染性疾病，基因治疗大致可分为两种思路：改造病毒宿主细胞使其免于感染和靶向病毒使其不能完成复制和传播。以HIV 病毒所致AIDS 的研究为例，HIV感染CD34+的淋巴细胞需要通过表面受体CCR5 或CXCR4 的介导。因此，可以将HIV 感染者的骨髓干细胞分离出来，通过CRISPR/Cas9 技术在体外将骨髓干细胞的CCR5 或CXCR4 受体基因失活，再将受体基因失活后的骨髓干细胞回输给该患者，重建其免疫功能。慢性乙型肝炎由人类乙型肝炎病毒(HBV)感染导致，是肝硬化和肝癌的主要诱因之一。HBV 的共价闭合环状DNA(cccDNA)对于病毒的持续性感染起了主要作用。因此， 清除被感染肝细胞内的HBV cccDNA 是临床上彻底治愈慢性乙型肝炎的关键。多项研究表明，CRISPR/Cas9 技术可以特异性地靶向HBV cccDNA，从而有效抑制HBV 的复制。
存在的问题
CRISPR/Cas9基因组编辑技术用于临床基因治疗还需要解决的问题主要包括：
(1) 建立有效、特异和安全的导入方式：由于CRISPR体系分子量较大，体内原位导入存在比较大的挑战，需要构建安全的导入载体，提升体内原位导入效率，增加细胞或组织特异性，以及增加对导入CRISPR材料的可控性 (如表达时间的控制)。
(2) 建立对脱靶效应的全面评估体系：基因组编辑可能导致的非预期基因的永久性突变会带来严重的副作用，因此需要在提高CRISPR靶向特异性的同时，选择或建立合适的脱靶检测平台或模型，提升脱靶率检测的敏感性和全面性，对可能脱靶率及其可能导致的安全问题进行高通量和全方位评估。
参考文献：
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