如何自制核酸探针？

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什么是核酸探针？

核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。这一过程被称为核酸杂交。其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。

探针应用

核酸探针技术作为分子生物学中常见的技术之一，是印迹杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。

探针制备

探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。探针制备流程如图1所示。Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。

图1. 探针制备流程。

随机引物法

随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。如果模板是RNA，则使用反转录酶。随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。

图2. 随机引物法的原理。

Protocol

试剂：
[α-³²P]dCTP (3000Ci/mmol)，dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L)，Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物，NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS） 5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。）

1、在一个 0.5 mL 的微量离心管中加入溶于 30 uL 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 uL 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。

2、使用PCR或者预热的水浴锅95℃热变性10min，迅速放冰上1min。

3、4℃离心混合物10s，重新置于冰上。

4、引物和模板的混合物中加入：

dATP, dTTP, dGTP	各1 uL
5X 随机引物缓冲液	10 uL
[α-³²P]dNTP	5 uL
水	至 50 uL

然后加入5 uL的klenow片段。

5、轻弹混合均匀,轻甩使液体降至管底。室温反应60min。然后加入10 uL的NA终止/贮存缓冲液。

6、制备好的探针-20℃保存。或者过柱后保存。原位杂交需要过柱。

缺口平移法

缺口平移法标记探针的基本原理是：先用适当浓度的DNA酶I在DNA分子的一条链上打开缺口(nick)，缺口处形成3’羟基末端，再利用大肠杆菌DNA聚合酶I的 5’→3’方向外切酶活性，将缺口处5’端碱基依次切除。与此同时，在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下，以另一条DNA链为模板，以带标记的dNTP为原料，顺序将dNTP连接到切口的3’羟基上，从5，端向3’端方向重新合成一条互补链。