筛选出阳性克隆后，应尽早克隆产生抗体的杂交瘤细胞。由于原始阳性孔中经常含有不止一个克隆的杂交瘤细胞，不分泌抗体的或者分泌无关抗体的杂交瘤可过度生产。并且由于染色体重排，杂交瘤分泌特性倾向于不稳定。细胞克隆就是为了确保产生抗体的细胞成为单克隆，而且具有稳定分泌的特性。
制备单克隆抗体的克隆技术的难易取决于原始阳性孔中细胞的来源。如果阳性孔中 含有多个克隆，且抗体分泌高度不稳定，那么至少应克隆三四次。
由于杂交瘤的克隆率很低，在单细胞克隆时常规的加入饲养层细胞或条件培养液。通常所用的饲养细胞来自于脾细胞，巨噬细胞，胸腺细胞或者成纤维细胞。
克隆化培养的方法，按照分离但克隆细胞的不同手段，大体上可分为有限稀释法，软琼脂平板法，显微镜操作法等数种，其中前两者较为常见。
1有限稀释法
此方法操作简单，当细胞悬液被连续稀释成足够多的份数时，就可能得到含有单个细胞的悬液，经过培养后单个细胞可增殖为同源性细胞克隆。首先计算每毫升培养液中杂交细胞的数量，用培养液稀释到每毫升7-10个细胞，将稀释的0.1ml培养液滴入到小培养板的孔中，每个孔理论上含有0.7-1个细胞，培养后即可获得单个细胞形成集落。
操作方法
1)克隆前一天，制备饲养细胞悬液，在96孔培养板的每孔中加入约100µL细胞悬液（105/ml）,置于CO2培养箱中过夜。在细胞融合后的第一次克隆化时，应将细胞悬于HT培养液中。
2)用弯头滴管将待克隆的杂交瘤细胞从培养板的小孔内轻轻吹下，计算每毫升的活细胞数。
3)用含有HT的完全培养基进行系列倍比稀释直至每毫升含有5，10，50个细胞，每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔分别含有0.5，1和5个细胞。
4)37℃,5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆或者倒置与显微镜下能够观察到杂交瘤细胞布满孔底1/5面积时就可以检测抗体，随后选择效价高，只有单个克隆生长的形态良好的细胞孔，继续进行1-2次克隆和扩大培养。
5)尽快将所得到的克隆细胞进行冷冻保存。
2 半固体琼脂平皿培养法
取定量琼脂，加少量磷酸盐缓冲液后，经高温蒸汽灭菌，融化，待冷却至39-40℃，加入DMEM培养液，使琼脂的最终浓度为0.5%。倒入铺有饲养细胞层的平皿内，待冷却以后，在其上层加入同上法配置的含不同细胞数的0.5%琼脂，冷却后加入5% CO2，37℃培养箱培养7-14天。在倒置显微镜下计算克隆数，用毛细吸管吸出克隆细胞，移种入含有饲养细胞和HT培养液的96孔培养板的小孔内，培养一段时间以后即可检测上清液中的特异性抗体。反复进行数次软琼脂克隆，直到可能从低密度繁殖的板上出现时，才可以认为是单克隆的细胞群。这种方法的优点是细胞容易在半固体培养基上存活与繁殖。
3 显微镜操作法
把1ml 1.0 ×108细胞悬液加入到直径6cm培养皿中，防止于37℃,5% CO2培养箱中30mins以上。然后使用倒置显微镜搜寻那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口水平置放于液面上，左右微动，对准细胞吸入毛细管，将管中细胞转移到每孔预先加有2.0×104-5.0×104个饲养细胞的96孔板内，培养后即可获得单个细胞形成的克隆。 此外还有荧光激活细胞分选仪（FACS）法，但是该仪器价格昂贵，使用的范围并不广泛。
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