在单克隆抗体的生产过程中,由于效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经选择培养基首次筛选出来的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异,须对杂交瘤细胞进行第二次筛选,选出能产生特异性性抗体的杂交瘤细胞。
筛选方法要求快速、灵敏、可靠而且利于一次性处理大量样品,因为数百个样品需要在短短几小时就得出检测结果,以便决定杂交瘤细胞的取舍。筛选的第一步是无菌吸取每个培养孔的上清液,用多头取样器进行。单抗筛选检测可供选择的方法有:固相放射免疫测定(RIA),可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测;酶联免疫吸附测定(ELISA),可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测;免疫荧光试验(IFA),适合于细胞表面抗原的McAb的检测;其他如细胞毒实验,空斑试验,间接血凝试验,旋转粘附双层吸附试验(SADIST),免疫金试验等。
现将常见且敏感的特异检测法简述如下:
1 RIA测定法
快速而完全的将反应后游离的,与抗体结合的抗原分离是进行放射免疫分析的必备条件。由于抗原—抗体复合物在低浓度时不能自行沉淀下来,因此常用物理,化学或者免疫学方法将其分开。在测定系统中,只有分离完全才能准确的分别测出游离的与结合抗原的放射性。
常用的有两种方法:
(1)双抗体法:即所谓的放射免疫沉淀法。此法是根据竞争性抑制原理,即标记抗原与待测的非标记抗原共同竞争一定量的相应抗体,待形成抗原—抗体复合物后,加入第二抗体进行沉淀,经离心洗涤以后,测定沉淀的脉冲数,如待测抗原批量多,则标记抗原的量变少,沉淀物的脉冲数也就低。
(2)固相法:将抗体包被于塑料管的内壁上,加入非标记的待测样品,温育,冲洗;再加入标记抗原,待测样品中含有非标记抗原与管壁上抗体部位结合,可抑制后加入的抗原与抗体的结合,保温后,将游离的抗原洗去,即可测定塑料管中的抗原—抗体复合物的放射性。该法可省去离心沉淀步骤,便于大批标本检测。
2 酶联免疫吸附测定——间接ELISA法
这是比较常见的检测法,原理是将抗原抗体的特异反应与免疫检测技术相结合。其可以间接检测有无抗体和抗原及其量。在一定条件下,抗原能结合到固相载体表面,并保持其免疫活性。若待测样品存在对此抗原特异性的抗体,就会结合载体表面的抗原。然后,与酶标记的第二抗体一起温育,即可根据酶解产物颜色的深浅,判断有无对应的抗体及其量的多少。
用于融合的骨髓瘤细胞由于是HPRT缺乏株,所以不能利用替代途径合成核苷酸而在选择培养基中死亡,而杂合细胞由于具有亲本细胞的遗传特性,可以在培养基中长期存活与繁殖。
3 亲和素-生物素ELISA法
亲和素与生物素有亲和性。活化后的生物素可与蛋白质,核酸等大分子物质偶联,可以被酶标记。一个蛋白质上可以连接多个生物素分子,形成多价生物素化抗体或者酶衍生物。一份子亲和素又可以结合四个分子的生物素,因此即产生多级放大作用。当亲和素与生物素酶作用时,很快形成亲和素-生物素酶复合物。反应体系中再加入生物素化抗体时,复合物中尚未饱和的亲和素结合部位即可以与偶联于抗体上的生物素相结合,抗体则与抗原结合,通过酶显色反应显示抗原的特异性。此方法灵敏度高,非特异性着色少。
4 其他方法
斑点试验测定法:本法是中国科学院上海细胞生物学研究所报道,对哺乳类如绵羊和鼠红细胞等的抗原测定是个较好的方法,用来对抗北京鸭红细胞单克隆抗体的试验收到较好的效果。本法还可以扩大应用到可溶性抗原,如蛋白质和半抗原的测定。
空斑试验及微球滤膜复制法:本法用来测定培养在软琼脂平板上的杂交瘤细胞,如抗原为红细胞,半抗原或蛋白质等。
免疫荧光法:免疫球蛋白试剂可以和荧光素结合,用荧光显微镜进行筛选。这是为适应大量检测需要而发展起来的一种检测手段,效果比较好。
筛选过程中需要注意以下几点:
1 杂交瘤细胞大多数不够稳定,除了筛选方法及早确定外,一旦阳性细胞群落选出来,就应该尽早进行克隆化培养及冷冻保存,以免染色体丢失,抗体的轻重链分离或非特异性细胞在同一个培养孔内的过度生长而影响匀一性。
2 对于只有一个群落的阳性孔里的杂交瘤细胞,除可取出部分细胞用作克隆化培养外,其余均可直接转入含有108小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞的小培养瓶,扩大培养,以便及时冻存。为了保险,也可以在原孔中留下少量细胞继续培养。
3 在吸取上清液时,每个培养孔应单独使用一支无菌的毛细管,且不要搅动培养孔中的细胞。进行检测的培养孔至少3天内不应换液,否则上清液中抗体可被稀释而影响其效价,甚至无法检测出。对已经取出小量上清液的各培养孔,需及时补充新的完全培养基继续培养。
4 所吸出的上清液当天就进行抗体检测,若必须延长至次日测定,应将标本存放于4℃冰箱。
5 测试时,在不同间隔,每孔测2-3次,阳性孔保留,阴性孔放弃。
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