如何鉴定CHO重组细胞系？

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动物细胞具有活性高、性能好、蛋白质可以正确折叠，且无中和性抗体，纯化工艺相对简单等优点。中国仓鼠卵巢（Chinese-hamster ovary, CHO）细胞是目前应用较广的哺乳动物表达宿主细胞，通过把外源目的基因稳定整合到CHO细胞基因组上的高表达位点，实现重组蛋白的高产。然而在重组蛋白大规模生产阶段，获得扩增的外源基因面临减少或丢失的风险，因此检测外源基因在CHO细胞基因组中的整合状态是必要的。

外源基因整合位点研究（Transgene Mapping）的方法主要有5种：基因组文库筛选、反向PCR、接头PCR、热不均一交替PCR、荧光原位杂交。

基因组文库筛选

该法根据已知序列设计探针，筛查文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分（不包含重复序列）作为新一轮筛查文库的探针，得到新的重组载体中的插入片段，它同上一个插入片段的末端部分，即探针序列，是重叠的。此法能克隆到整合位点，真实反映转基因在宿主基因组中的存在形式和存在状态，但技术性较强，成本太高，已较少用于大批量转基因事件的鉴定。

反向PCR

首先选择在已知序列中无切点的限制性内切酶对DNA进行酶切，然后用DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片段，再以该环状DNA分子为模板，根据已知序列的两端设计反向引物进行PCR，从而得到已知序列的旁侧序列，经测序比对后可知整合位点的所在。该法对模板质量和数量、自体环化率要求较高。

接头PCR

接头PCR的原理类似反向PCR，首先也是选择在已知序列中无切点的限制性内切酶对DNA进行酶切，然后利用DNA连接酶将酶切片段与接头序列相连接，根据已知序列和接头序列设计引物，进行嵌套式PCR扩增，从而得到从已知序列到接头序列之间的未知序列，再经BLAST比对后检测出整合位点。该法避免了限制性片段的自身环化，提高了效率，同时接头可以是单链也可以是双链。

热不均一交替PCR

热不均一交错 PCR（TAIL-PCR, thermal asymmetric interlaced PCR）利用3个嵌套的特异引物（SP primer）分别和一组较短的随机简并引物（AD primer）组合引发巢式PCR扩增。这种方法可以有效率地获得较长的侧翼序列并且特异性高，操作简单，目前已经广泛用于外源片段整合位点的研究中。

荧光原位杂交

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）依靠核酸探针杂交原理在核内或染色体上显示DNA序列位置，大多以中期染色体为靶体，用荧光素标记探针与染色体上的NDA进行杂交，然后用荧光显微镜进行观察，对所要检测的DNA进行定性、定量或定位。作为检测外源基因整合的方法，FISH 较 PCR、qPCR、Southern blot、 Northern blot 等方法更为直观，并可实现染色体定位。这对研究外源基因的位置效应、提高外源基因的表达效率具有重要意义。

通过FISH方法进行的Transgene Mapping是一种行之有效且经济的技术，既可以应用于染色体排序和杂合性状态评估，又可以用于已经通过分子生物学方法获得高分辨率的Mapping的验证。基于FISH的方法，尤其是借助专门设计的用于数字图像分析的软件的帮助，对于用户更加友好。根据所用荧光成像系统的规格，FISH法可能需要多次连续的杂交才能最终确定转基因插入片段的染色体位置。

以下是荧光原位杂交检测重组细胞系CHO的通用实验方法：

细胞培养

1) CHO细胞复苏后转入摇瓶，37℃、5% CO₂、120 r/min条件下培养。

2) 每3天传代一次。

染色体制备

1) Nocodazole阻滞细胞至M期，0.56%KCl 溶液悬浮细胞。

2) 固定液（甲醇与冰醋酸 3∶1）固定。

3) 调整细胞悬液至合适浓度，滴加至玻片上。

4) RNase A处理。

5) 系列乙醇脱水（70%，90%，100%）。

6) 胃蛋白酶消化。

7) 甲酰胺固定。