组蛋白存在于真核细胞中，是将DNA包装到核小体中的蛋白质。核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4以二聚体形式存在，聚集在一起构成一种八聚体形式存在。大约146bp的染色质DNA缠绕在该八聚体上，共同构成核小体的结构。核小体再通过一种H1组蛋白相互连接，共同构成真核生物染色质。
组蛋白的甲基化修饰是指发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或者赖氨酸残基不同位点上的不同程度的甲基化。组蛋白的翻译后修饰参与各种重要的生理功能，比如DNA复制和修复、RNA转录等等。组蛋白翻译后修饰以组合方式起作用，以调节与染色质相关的各种活性，当它们失衡时，可能会导致疾病产生，例如癌症。越来越多的证据表明，核小体的修饰和各种组蛋白变体的存在或缺失共同作用于表观遗传信息的编码，即基因表达的最终调控。
今天为大家介绍利用质谱对组蛋白翻译后修饰研究的常用策略。
➢ 组蛋白的提取和纯化
大多数组蛋白的提取工作是基于组蛋白在酸中的溶解度，这些酸可以是稀盐酸，也可以是硫酸，在这种条件下，大多数其他核蛋白和核酸会沉淀。需要注意的是，当酸性提取法应用于植物细胞、黏菌和一些真菌(包括酵母属)时，可能会产生一种含有大量碳水化合物和多酚的组蛋白制剂，它们容易交联和氧化组蛋白。
如果想要发现新型PTMs，明智的做法是使用其他的组蛋白提取技术，比如可以利用高盐提取来代替典型的酸提取，这是因为一些组蛋白修饰在酸性环境下可能非常不稳定（如His磷酸化)。
高盐萃取是一种替代酸萃取的有效方法。首先，保持中性pH，因此酸不稳定的组蛋白修饰都应会保留。其次，酸提取和随后的三氯乙酸沉淀有时会产生不溶性物质，其中可能含有组蛋白，从而降低了制剂的收率。总之，可以根据自身研究样品来选择组蛋白的提取方式。随后，可利用反相高效液相色谱（Reversed phase HPLC，RP-HPLC）进行组蛋白的纯化。
图1 组蛋白分离纯化（Shechter et al, 2007）
➢ 质谱分析
对于纯化后的组蛋白，在这里介绍三种处理策略，进行随后的质谱分析。
1. Bottom-up
Bottom-up首先使用蛋白酶对蛋白序列进行酶切，再对酶切后的肽段进行鉴定，再根据肽段序列再推导出蛋白序列。该分析方法应用于组蛋白修饰研究时，需要先酶解组蛋白成一定大小的肽段，这会导致蛋白质不同部分间的连接位点丢失，从而不能区分蛋白质序列变异体。因此，该方法不适合分析组合式组蛋白翻译后修饰密码。
2. Middle-down
对于组蛋白分析来说，middle-down分析方法是一种替代方法。由于组蛋白N端尾部的Asp和Glu的缺失，可以通过GluC或AspN酶切产生较大的肽段。利用该方法，蛋白质通常被消化成3-9 kDa范围以内的肽段。Middle-down分析方法逐渐受欢迎，这不仅是因为仪器方面的进步，也是因为人们认识到，该方法保留了组蛋白尾部的组合修改，同时也更接近于bottom-up方法的敏感性。
3. Top-down
Top down是指从一个完整的蛋白出发，不需要消化步骤，直接在质谱中进行碎片化处理进行碎片检测的方法。组蛋白体积小且相对丰度高，适合于自上而下的分析。这种方法能够区分不同的组蛋白变体和蛋白形式，还可以提供有关所有修饰的化学计量的信息，因此，它适合于组蛋白密码的全面表征。然而，尽管在仪器方面取得了进步，top down方法相对bottom up来讲仍然不敏感，并且需要大量的样本，同时，难以检测低丰度蛋白的形式，而且产生的碎片离子谱图解析也较困难。
方法各有优缺点，大家可以根据自己的研究需求及经费选择适合自己的翻译后修饰研究方法，扬长避短，获得满意的质谱结果。
参考文献：
孙瑞祥, 罗兰, 迟浩, 等. "自顶向下 (Top-down)" 的蛋白质组学: 蛋白质变体的规模化鉴定[J]. 生物化学与生物物理进展, 2015, 42(002): 101-114.
Shechter D, Dormann H L, Allis C D, et al. Extraction, purification and analysis of histones[J]. Nature protocols, 2007, 2(6): 1445.
Moradian A, Kalli A, Sweredoski M J, et al. The top‐down, middle‐down, and bottom‐up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post‐translational modifications[J]. Proteomics, 2014, 14(4-5): 489-497.
