一、动物细胞培养基本概念
动物细胞培养是用无菌操作的方法从动物体分离得到细胞,将它们置于模拟动物体内生理条件的人工环境中,在体外进行培养并使其继续生长的过程。人们借以该技术可以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等生命现象。动物细胞培养的培养物可以是单个细胞,也可以是细胞群。
二、动物细胞培养分型
根据离体培养细胞在培养皿中是否贴壁生长,分为贴壁型 和悬浮型。
(一) 贴壁型
培养细胞需要贴在支持物上生长,大多数细胞属于此类型。贴壁生长以后分化就变得不太显著,易失去原有细胞组织特性,形态上表现单一化,失去其在体内原有的一些特征,并且反映出其在胚层起源情况,判断细胞形态时不能按照体内组织学标准判定,仅大致分成以下类型:
1、成纤维型细胞:(fibroblast)
与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出 2~3 个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状。除真正的成纤维细胞外,凡由中胚层间质起源的组织细胞,如心肌,平滑肌,成骨细胞等常呈现此型态。
特点:排列呈放射状,旋涡状生长。
2、上皮型细胞(epithlium cell type)
其指形态上类似上皮细胞的多种培养细胞,细胞呈现扁平不规则多角形,中央有圆核,细胞相互依存性强,彼此连接成单层膜。生长时呈膜状移动,边缘细胞很少脱离细胞群而单独活动,起源于内,外胚层的细胞如皮肤表皮细胞及其衍生物,消化管上皮,肺泡上皮等都是这类型。
特点:扁平不规则多角型、圆形核、细胞紧密相连,细胞增殖数目增多时,整个上皮膜随之移动。
3、游走型细胞(wandering cell type)
特点:细胞在支持物上散着生长,不连接成片,胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则, 密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞区别。
4、多形型细胞(polymorphic cell type)
特点:无规律的形态,如神经细胞难以确定其规律及稳定的形态,可同归于此类。
(二)悬浮型
某些细胞呈悬浮状态生长,在瓶皿内不贴壁,其生存空间大,能繁殖大量细胞,容易传代培养,但在观察细胞病变时不如贴壁细胞。血液中的淋巴细胞,白细胞以及某些肿瘤细胞属于悬浮细胞。
三、培养细胞的生命期
指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。在培养体系中,单个细胞表现有很大的独立性。但一个有活力的细胞必须通过细胞周期进行倍增,繁殖成群体,群体细胞是培养细胞的基本存在形式,而且在形态和机能上相互依存。
单个细胞生长周期(细胞周期):
细胞生长包括DNA合成和细胞分裂两个重要阶段。细胞周期即一个母细胞分裂形成两个子细胞的全过程,可分为间期(G1+S+G2)和分裂期(M期)。在间期,细胞完成生长过程,主要是DNA合成。M期为有丝分裂期,此时每个细胞分裂为2个细胞。在M期主要完成的是遗传物质的分配过程。
细胞系的生长过程:
取自动物并进行体外培养的细胞在其传代培养之前被称为原代细胞,当细胞维持一段时间的生长,达到一定密度以后就要被分离为2个或者多个培养皿培养,这个过程为传代培养,传代以后生长的细胞便是细胞系。
体外培养的细胞生长过程一般为3个阶段:
1)原代培养期(约为 1~4 周)
细胞移动活跃,但分裂不旺盛,多呈二倍体核型。原代细胞与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。各细胞的遗传性状互不相关,细胞相互依存性强,如果把这种细胞稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养,细胞克隆的形成率下降,表明细胞独立生存性差。
2)传代期
细胞增殖旺盛,并维持二倍体核型,也叫二倍体细胞系。为了保存二倍体细胞性质,细胞应在初代或传代早期冻存为好。传代大约数天至一周可重复一次,持续数月,即为细胞系,一般为有限细胞系。
3)衰退期
细胞仍生长,增殖减慢,不增殖,进而衰退凋亡。
注意:细胞在三期中的任何一期(一般发生在传代后期或衰退期)在某些因素影响下,
如血清质量不佳、病毒污染、温度和 pH 不稳等,细胞可能发生自发转化。
细胞可能获得永生性。细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系。而细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体接触抑制消失。至今,国际以及国内已经建立了许多细胞系,大多数来自肿瘤细胞。
四、细胞培养的应用
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
1、基础科学研究
(1) 细胞生物学
(2) 基因功能学科
(3) 遗传学
2、药物研究与开发
(1) 新药筛选:如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。
(2) 疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
(3) 基因工程药物生产:如临床上一些具有治疗价值的细胞生长因子(干扰素)的研发与应用。
(4) 细胞工程药物生产:生物活性多肽研究与开发,人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。
(5) 单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体。
目前,动物细胞生产的各类疫苗,单抗,干扰素等,已占据了大部分市场。随着细胞培养技术的发展,会有更多具有医药价值的生物制品问世,造福于人类。