蛋白合成起始于N-端,蛋白质N-端的序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着影响力。例如N-端序列影响蛋白质的半衰期,同时关联着蛋白亚细胞器定位等,这些与蛋白的功能和稳定性息息相关。对蛋白进行N-端测序分析,有利于帮助分析蛋白质的结构,了解蛋白质的生物学功能。
C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位,对蛋白质的生物功能起作用。此外,由于蛋白翻译后在细胞内需要进一步剪切和修饰,通常不能简单的使用基因序列对C-端或N端做简单的预测,对于蛋白生物制品来说,使用C-端测序是可行的,随着蛋白质组学研究的不断深入,蛋白质C端测序对其功能研究将发挥作用。一些新的蛋白质C端测序方法已建立,提高了灵敏度和重复性,能够在蛋白质组水平应用。
技术原理
蛋白质和多肽N-端测序技术是以Edman化学降解法为基础的,Edman化学降解,其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基的偶联,苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)环化裂解,和噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三个主要的化学步骤,每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基,同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个Edman降解,然后通过转移的PTH-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。
尽管Edman法技术已应用较多,但仍有不尽人意之处,例如Edman降解法不能解决N端封闭的测序问题(环化、封闭)、被修饰的蛋白不能给出确切的信号,要求蛋白或多肽的纯度在95%以上,灵敏度较低。质谱法不受N末端封闭的限制,能对侧链基团翻译后加工或化学修饰进行定位,灵敏度有提高,因而具有其优点,与传统的Edman降解法相互补。
蛋白质的C末端分析,并不能采取类似N端氨基酸序列分析的化学分析,现阶段是采取质谱法对蛋白质样品的C末端序列分析。其原理为利用蛋白质在质谱中会有规律的破碎,获得蛋白质肽段的碎片,分析图谱得到蛋白质的C-端序列。
样品要求:
蛋白质样品可以是干粉、溶液或固定在PVDF膜上(转膜的蛋白质分子量不超过20KD,用丽春红染色);
样品浓度及纯度:浓度>50pmo l,纯度>90% (建议提供的样品量为所需量的5倍以上);
含盐量:不挥发无机盐<5mM ,挥发性无机盐<20mM ,不能使用Tris 缓冲体系